多重PCR方法一直在肿瘤和遗传病基因组学研究方向有着广泛的应用。和传统PCR方法不一样的地方在于，经过PCR反应体系的优化和特异性引物组的设计，可以将几十上百对引物在一个PCR体系中一次性反应。由于对目标序列进行了特异性的扩增，因此对下游的建库、测序、分析要求都相较其他方法方便、快速、成本低。

新冠病毒属于新发病原，尚未有大规模的变异和重组，且已经有了完整的参考基因组序列。临床标本尤其上呼吸道拭子拷贝数极低，ct值常常高达35，宏基因组学不再适用于获取这类样本的全序列，相较而言，多重PCR是一个值得一试的方法。

探普生物基于在病毒测序领域的长时间深耕，在扎实的理论和实践基础上，设计了整套用于获得新冠病毒全序列的多重PCR实验流程和分析流程。

实验设计

reference：NC_045512.2

引物设计：114对引物，覆盖99%以上新冠序列，overlap 75bp，扩增子为400bp

测序平台：Novaseq6000 PE250，Miseq PE250

分析流程：质控后附加去除PCR引物序列流程，以去除可能由PCR引物引入的突变。

测试结果

我们选了ct值分别为23和35的两个咽拭子的total RNA分别进行了宏基因组和多重PCR方法的测序和分析。下表从数据量、数据质量、组装效果、基因组覆盖度、测序深度等方面对样品进行了比较。

表1 结果对比

如表，只关注样本中的新冠基因组时:

• 选用宏基因组测序和多重PCR测序所需的raw data分别为10Gb+和100Mb。

• 宏基因组即使测得10Gb以上的数据量，ct值稍高也很难获取较为完整的全基因组；即使ct值低至23，获得的全基因组的测序深度也仅为24。

• 选用多重PCR方法，样本的ct值即使高至35%，只要选择优化的体系，依然可以获得覆盖度98%，深度100×以上的拼接结果。

因此，无论从成本还是数据拼接效果来看，仅关注新冠病毒这一物种时，ct值高低都可选择多重PCR方法。

样本要求

探普生物已经正式上线基于多重PCR方法的新冠全序列扩增试剂盒及测序分析服务，以下为样本要求：